ISOLASI DNA

      Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sedasar teori. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua

informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).

            DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah,

            DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.

Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.

Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah alkohol dingin 96%.

·         Elektroforesis

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik bergantung pada muatan, bentuk, dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjaidnya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bermigrasinya molekul-molekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga sering dipakai dalam elektroforesis atara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gell. Gel poliakrilimad dan agarosa merupakan matrik penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukelat. Beberapa faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996)

1.      Ukuran molekul protein, migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil,

2.      Konsentrasi gel, migrasi molekul protein pada gel berkonsentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi,

3.      Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjaid maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat,

4.      Medium penyangga, ideal untuk elektroforis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatifi stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996),

5.      Kekuatan voltase, jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecl akan berpindah lebih bebas didalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya.

6.      Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.

A.    Alat dan Bahan

·         Isolasi DNA

Alat:

-          Lampu UV

-          Beaker glass

-          Spatula

-          Mikropipet beserta tipnya,

-          Tabung mikrosentrifuga 1,5 ml

-          Vortex

-          Waterbath

-          Mikrosentrifuga

-          LAF

-          Freezer

-          Sarung tangan

-          Mortar dan pestle

-          Timbangan analitik

-          Tabung reaksi

Bahan:

-          Sampel daun kelapa

-          Alkohol 70%

-          Alkohol 96%

-          Akuades

-          CTAB (cetyltrimethylamminium bromide)

-          Β-merkaptol

-          KIA (kloroform: Isoamilaalkohol= 24:1)

-          Isopropanol

-          Bufer TE,

-          RNAse

-          Amonium asetat

·         Elektroforesis

Alat:

-          Labu erlenmeyer 50 ml

-          Tabung mikrosentrifuga

-          Sarung tangan

-          Timbangan analitik

-          Microwave

-          Tray

-          Masker

-          Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

-          Kertas parafilm

-          Seperangkat alat elektroforesis

-          UV trnasluminator

-          Kamera

Bahan:

-          DNA marker

-          Sampel DNA (DNA tanaman hasil isolasi)

-          Agarosa

-          Larutan TBE buffer

-          Akuades

-          Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue)

-          Larutan Etidhium Bromid (EtBr)

B.     Cara Kerja

·         Isolasi DNA

1.      Mengenakan alat pelindung kerja

2.      Memanaskan larutan CTAB (buat fresh) sebanyak 2 ml dalam tabung reaksi dengan menggunakan waterbath pada suhu 65 derajat celcius

3.      Mengambil daun kelapap seberta 1 gram, meletakkan ke dalam mortar dan menuangkan nitrogen cair ke dalam mortar secukupnya,

4.      Secepatnya menggerus daun sebelum nitrogen cair menguap sampai daun hancur menjaid tepung,

5.      Memasukkan tepung daun ke dalam larutan CTAB

6.      Menginkubasi selama 1 jam pada waterbath pada suhu 65 derajat celcius, mengocok tabung setiap 15 menit sekali,

7.      Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit

8.      Memeindahkan supernatant ke tabung ependorf 2ml dan disentrufugasikan kembali selama 20 menit pada kecepatan 11000 rpm,

9.      Memindahkan supernatant ke tabung baru sebanyak 1 ml dan ditambahkan campuran isoamoil alkohol : kloroform ( 1:24) sebanyak 0.5 ml,

10.  Sampel kemudian dicampur dengan cara flicking sampai bercampur kemudian disentrifugasi kembali selama 10 menit pada keceoatan 11000 rpm,

11.  Bagian atas dari larutan kemudian dipindahkan ke tabung ependrof yang baru dan menambahkan ethanol absolut (5 derajat celcius) sebanyak 1 ml dan amonium asetat sebanyak 100 uL secara perlahan-lahan

12.  Sampel kemudian dicampurkan secara perlahan dan disimpan didalam lemari es selama 1 malam agar DNA menggumpal dan mengendap,

13.  Hari berikutnya, tabung kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13000 rpm, larutan kemudian dibuang dan pelet kemudian dicuci secara hati-hati dengan menggunakan ethanol (1 ml). sampel kemudian dikeringkan didalam LF sampai kering (Sekitar 2-13 jam)

14.  DNA kemudian dilarutkan kembali dengan menambahkan TE buffer sebanyak 300 uL dan disimpan didalam lemaro es (-20 derajat celcius) untuk digunakan dalam proses elektroforesis.

·         Elektroforesis

1.      Membuat agarosa

-          Berat 150 ml untuuk 1,5 gram dalam 100 ml TBE Buffer

-          Berat 40 ml untuk 0,4 gram dalam 100 ml TBE Bufder

2.      Melarutkan dan mendidihkan hingga larut sempurna,

3.      Menimbang dan mencatat hasilnya,

4.      Memasukkan ke dalam microwafe sampai larut

5.      Menimbang kembali beratnya, jika terjadi peengurangan berat tambahan kembali buffer sampai sama seperti semula,

6.      Menuangkan di tray sampai mengeras dan letakkan sisir elektroforesis,

7.      Mengambil sisinya dengan hati-hati jika sudah keras dan agar disimpan pada alat elektroforesis DNA,

8.      Melarutksn buffer harus diatas 1ml diatas gel agar

9.      Menyiapkan DNA (jika padat atau beku dicairkna terlebih dahulu)

10.  Masukan 10 mikroliter sampel DNA dan 2 mikroliter loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet,

11.  Membuat catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan,

12.  Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki eletroforesis (memastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutib negatif berada di dekat sumuran, jika tidak demikian, mengubah posisi baki/gel ke arah sebaliknya),

13.  Menyalakan sumber arus, mengatur voltase dan waktu running hingga diperoleh angla 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus,

14.  Jalankan elektorforesis (lakukan running) dengan cara menekan tomol run pada sumber arus,

15.  Elektroforesis akan terhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis,

16.  Keluarkan gel dan masukkan kedalam larutan etium bromida kemudian diletakkan diatas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam diatas UV transluminator)

17.  Menyalakan UV transluminator, mengatami pita-pita DNA yang tervisualisasikan,

18.  Mengambil fotonya diatas UV agar terlihat jelas.

C.     Hasil Pengamatan

Ø  Gambar hasil pengamatan

           

D.    Pembahasan

-          Isolasi DNA

            Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil. Selain perusakan secara fisik, membrane dan dinding sel dapat pula dirusak dengan menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan membrane sel pada praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara penggerusan. DNA yang didapatkan dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus.

Apabila dilihat dari sumber DNA yang digunakan untuk pengisolasian ini, sumber DNA menghasilkan DNA yang berbentuk benang-benang halus berwarna sesuai dengan warna asal sumber tersebut. Suatu sumber menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun, masalah pengaruh keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah air yang digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental..

Dari praktikum yang sudah dilakukan, dapat diketahui bahwa tidak semua isolasi DNA dari setiap kelompok berhasil. Isolasi DNA yang berhasil akan memunculkan benang-benang halus yang mengendam didasar tabung sebagai indikasi itu adalah DNA yang akan digunakan untuk praktikum elektorforesis selanjutnya.

-          Elektroforesis

Dari hasil praktikum yang dilakukan terdapat:

a.       Pembuatan gel

Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elektroforesis pada erlenmeyer, kemudian dicetak pada cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga padat. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya hasus sesuai, karena jika tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan,

b.      Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan. Kemudian sampel DNA pada hasil praktikum isolasi DNA dimasukkan pada masing-masing sumur agar

c.       Proses elektroforesis

Sesuai dengan cara kerja

d.      Metode analisis

Dalam hal ini cara menganalisis hasil pita elektroforesis tersebut sangat bergantung dari topik yang akan diteliti. Hasil visualisasi kromosom berupa binti atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam bandmorp dibedakan atas pola pita yang terbentuk. Semuaa tipe pola pita yang terbentuk diintrepestasikan sebagai lokus isozim dan alel.

E.     Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan, maka dapat diambil kesimpulan, bahwa :

1.      Cara pengisolasian DNA dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi. Cara mekanik dengan alat-alat yang berfungsi untuk menghancurkan membran sel. Sedangkan secara kimiawi dengan penambahan-penambahan reagen, yaitu alkohol dingin 96%.

2.      Tahap-tahap dalam isolasi DNA ada tiga. Tahap pertama dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan, Tahap kedua isolasi DNA adalah melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan garam ke dalam campuran. Pemberian detergent berfungsi untuk membuka atau memecah membran sel (baik membran sitoplasma maupun membran nukleus. Tahap ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan manambahkan alkohol dingin 96%. Alkohol berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-molekul lain,seperti protein.

3.      Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik bergantung pada muatan, bentuk, dan ukuran.

Posted in: laporan praktikum